Lančana reakcija polimeraze predstavlja postupak iz molekularne biologije koji duplicira dijelove iz genetskog materijala (deoksiribonukleinska kiselina, DNA). Milijuni identičnih kopija proizvedeni su iz malih količina DNA. Na taj su način dostupne količine dovoljne za razna ispitivanja.
Što je lančana reakcija polimeraze?
Lančana reakcija polimeraze predstavlja metodu iz molekularne biologije koja duplicira dijelove iz genetskog materijala (deoksiribonukleinska kiselina, DNA). Pojam lančana reakcija polimeraze (PCR) opisuje in vitro (latinski: u čaši) reakciju uz pomoć enzima, polimeraze (DNA polimeraze), što dovodi do dupliciranja određenih gen sekvence. Produkt reakcije je ujedno i polazni materijal za novi ciklus ove reakcije. Broj molekule udvostručuje se i istovremeno služi kao predložak za novi ciklus. To se naziva eksponencijalno množenje. Odvija se u laboratoriju velikom brzinom od nekoliko minuta, slično lančanoj reakciji. Ovaj laboratorijski postupak oponaša dupliciranje genetskih informacija (DNA) koje se javljaju u prirodnim uvjetima tijekom replikacije. Američki kemičar KB Mullis smatra se otkrivačem ovog postupka. 1983. predstavio je ovaj postupak sinteze DNA i deset godina kasnije dobio je Nobelovu nagradu za kemiju.
Funkcija, učinak i ciljevi
U živim organizmima DNK u kromosomi ima duljinu koja se ne može pojačati pomoću PCR-a. Umjesto toga, primjenjuje se za pojačavanje definiranog odjeljka. To mogu biti geni, određeni dio a gen, ili regije koje nisu transkribirane u proteini, tj. nekodiraju. Ti odjeljci obično sadrže najviše tri tisuće parova baza, u usporedbi s približno dva puta tri milijarde parova baza po skupu kromosomi kod ljudi. Lančana reakcija polimeraze zahtijeva jednolančani ili dvolančani DNA lanac čija struktura mora biti barem djelomično poznata. Uz enzim, polimerazu, koriste se dvije početnice. To su gradivni blokovi DNK koji djeluju kao početna i krajnja točka. Karakterizira ih slijed koji točno odgovara regiji koju treba pojačati. U laboratoriju se lančana reakcija polimeraze provodi u programabilnom grijaćem bloku. Potrebne komponente kao što su polimeraza, primer, građevni blokovi za izgradnju novog lanca (deoksiribonukleozid trifosfati) i magnezij ioni se zbrajaju u puferskoj otopini. Program temperature i vremena za reakciju započinje denaturacijom na temperaturi iznad 94 ° C. U ovom se postupku dvolančana DNA cijepa i prisutna je u jednolančanom obliku. U sljedećem koraku, na oko 70 ° C, temeljni premaz veže se na gen slijed i tvori polaznu točku za enzimsku reakciju. Odavde polimeraza sintetizira komplementarni lanac. Tada započinje novi ciklus, koji se opet sastoji od tri koraka denaturacije, vezivanja početnica i sinteze lanca DNA. Lančana reakcija polimeraze koristi se u sudskoj medicini, kliničkoj dijagnostici i kliničkim istraživanjima. U forenzičkoj znanosti izvlači se DNA koža, slina, kosa, sjeme ili krv s mjesta zločina i, nakon pojačanja, uspoređuje se s poznatim uzorcima i koristi se za identifikaciju određenih pojedinaca. Korištenjem ovog genetskog otiska prsta, očinstvo se također može razjasniti modificiranim pristupom. U rasvjetljavanju bolesti, lančana reakcija polimeraze koristi se za provjeru uključenih gena. Neke se bakterijske bolesti mogu klasificirati prepoznavanjem određenih sekvenci. Virusne bolesti mogu se okarakterizirati kada se virusna DNA ili RNA transformira i pojača. U krv screening, moguće je otkriti hepatitis ili HIV-posredovane bolesti u vrlo ranoj fazi. U dijagnostici tumora koristi se za identificiranje tumorskih stanica. To omogućuje klasificiranje tumora, procjenu tijeka bolesti, uspješnosti terapija i prognoza. U istraživanju se lančana reakcija polimeraze koristi za identificiranje gena povezanih s raznim bolestima. Za kloniranje gena, što nije isto što i kloniranje organizma, gen se pojačava prije nego što se u vektor prenese u druge organizme (latinski: putnik, nosač ). Oni mogu djelovati kao modeli za bolje proučavanje bolesti ili stvaranje proteini koja se može koristiti kao droge.
Rizici i opasnosti
Lančana reakcija polimeraze ima ogroman potencijal u otkrivanju malih količina DNA. Da biste iskoristili mnoštvo mogućnosti i zaštitili se od značajnih pogrešaka, moraju se uzeti u obzir određeni preduvjeti i razni izvori pogrešaka. Mogu se pojačati samo dijelovi genetskog materijala čiji je slijed barem djelomično poznat. Potpuno nepoznate sekvence ne mogu se pojačati ovom metodom. Proizvodi pojačanja mogu se vizualizirati nakon toga. Ako očekivani signal nije vidljiv, iako je traženi slijed prisutan, prisutan je lažno negativan rezultat. Najčešće je to rezultat neoptimiziranih ili slabo optimiziranih reakcijskih uvjeta. Oni se moraju odrediti kao funkcija ciljne sekvence. U tu svrhu ispituju se različiti temperaturni i vremenski profili, sljedovi i količine početnih slojeva, kao i koncentracije drugih tvari u reakcijskoj smjesi. Lažno pozitivni rezultati pokazuju se kao signali koji se ne mogu dodijeliti željenom proizvodu. Glavne probleme uzrokuju onečišćenja s DNA koja potječe od istražitelja ili iz izvora koji nije izvor koji treba analizirati. DNA bakterijskog podrijetla također utječe na rezultat lančane reakcije polimeraze. Nošenjem rukavica i velikom pažnjom mogu se spriječiti takve pogreške i formulirati pouzdani zaključci o pojačanim proizvodima.
