Napomena: Sljedeći je članak uvršten u ostale konvencionalne terapije jer zaseban odjeljak još nije dostupan za eksperimentalne metode molekularne biologije izvan humane medicine. CRISPR / Cas metoda je molekularno biološka metoda za ciljano rezanje kao i za modificiranje DNA (uređivanje genoma; gen škare). 1987. godine znanstvenici su otkrili prethodno nesmotreni adaptivni imunološki sustav u E. coli. To se temelji na takozvanim CRPSPR sekvencama (grupiranim redovito isprepletenim kratkim palindromskim ponavljanjima) unutar DNA. E. coli integrira DNA bakteriofaga (skupine od virusi koji se specijaliziraju za bakterija kao stanice domaćina) CRSPR sekvenca vlastite DNA, prepisujući tako crRNA (prepisivanje DNA u RNA). CrRNA se sastoji od razmaknih i ponavljajućih sekvenci. Spacer sekvence su sekvence "izvađene" iz bakterija. Takozvana trRNA (tracrRNA) veže se za imenovane sekvence ponavljanja. Regrutira CAS9 enzim. Sada je prisutan kompleks - kompleks crRNA: tracrRNA: Cas9 - koji je sposoban vezati DNA bakteriofaga komplementarno sa svemirskim sekvencama crRNA. Kao takozvana endonukleaza (enzim za rezanje DNA, dakle restrikcijski enzim), CAS9 reže virusnu DNA na dvolančani način, što u konačnici dovodi do nemogućnosti replikacije (tj. Bez daljnje replikacije i posljedično bez daljnje integracije). Više od desetljeća ovaj se postupak koristi s naglaskom u istraživanjima uređivanja genoma. Opisana "crRNA: tracrRNA: Cas9 kompleks" univerzalno je primjenjiva na biljke i životinje i omogućuje uklanjanje (brisanje) i krajnje utišavanje gena. Upotreba izvan istraživanja utvrđena je više od 5 godina u poljoprivredi i prehrambenim usjevima za podnošenje suše, kao i za poboljšanje imunizacije protiv virusnih patogena. Postupak bi se kasnije mogao koristiti u humanoj medicini. Od 2020. godine prvi put postoji kurativni terapijski pristup za bolest s urođenom bolesti srce defekt (vitium) kod djece. Vitij je dio složene nasljedne bolesti Noonanov sindrom (autosomno recesivno ili autosomno dominantno nasljeđivanje). Nakon dešifriranja uzročnih inačica LZTR1 gen, odgovarajuća korekcija gena generiranih induciranih pluripotentnih kardiomiocita (srce mišićne stanice) iz matičnih stanica blizanaca. The gen regulira bitne signalne putove za diferencijaciju i rast stanica.
Prije ove potencijalne terapije u humanoj medicini
Molekularno genetsko ispitivanje nasljednih poremećaja kod roditelja, uključujući sveobuhvatno genetsko savjetovanje.
postupak
Postupak je sličan onome obrambenog mehanizma E. coli opisanog u imunološki sustav. U ovom procesu, razmakni dio crRNA može se modificirati kako bi se izrezala dvostruka lančana komplementarna DNA specifična za sekvencu, što rezultira ciljanim delecijama. Kemijski modificirana molekula trRNA: crRNA naziva se vodička RNA. To zahtijeva dvije različite komplekse crRNA: tracrRNA: Cas9 da se prikače na dva mjesta u DNA. Nakon uklanjanja DNA fragmenta, ligazama dolazi do enzimskog povezivanja 2. DNA fragmenata. To se razlikuje od pukog rezanja sekvence DNA kao kod bakterije. Tijekom godina dodane su osnovne tehnike modeliranja. Oni omogućuju ne samo delecije unutar lanca DNA, već i dodavanje (insercije) novih DNA nukleotida. Modifikacija koja najviše obećava je glavno uređivanje. Ovdje nakon brisanja, a time i uklanjanja fragmenta DNA, slijedi umetanje novog fragmenta DNA. Ovdje je dostupan takozvani pegRNA (glavni vodič za uređivanje RNA) kao transkript DNA koja se ubacuje. Uz pomoć reverzne transkriptaze, pegRNA se transkribira u DNA i ugrađuje u DNA, opet koristeći ligaze. Protein CAS9 potreban za ovaj postupak stvara jednolančane umjesto dvolančanih posjekotina. To omogućuje umetanje novog fragmenta DNA s preciznim uklapanjem u izrezani DNA lanac s isturenim krajevima. Nova je modifikacija temeljna za razmjenu "patološke" sekvence DNA prema "nepatološkoj" u budućnosti u kontekstu nasljedne bolesti.
Nakon terapije
Još jednom se provodi genom kako bi se potvrdio uspjeh uređivanja genoma.
Moguće komplikacije
Zbog mogućih osnovnih neusklađenosti vodiča RNA mogu se dogoditi neciljni učinci, tj. Vezivanje na neželjenom mjestu. To može uzrokovati točkaste mutacije (promjene baze), umetanja (ugradnja dodatnih nukleotida ili DNA sekvenci u DNA sekvencu), brisanja (gubitak ...), translokacije (promjena položaja DNA) i inverzije (prisutnost DNA segmenta pretvorenog 180 stupnjeva). Enzim CAS9 ne reže se na željenom mjestu u svakom slučaju. Međutim, povećanje specifičnosti već je ostvareno promjenama u dizajnu proteina. Također, povezivanjem CAS9 s endonukleazom Fokl, također izvedenom iz bakterija, specifičnost bi se mogla povećati na 1: 10,000 1 (bez drugih preinaka, samo specifičnost do 2: XNUMX).
