Što je PCR test?
PCR test je laboratorijska metoda koja se koristi u molekularnoj biologiji i medicini. Test se koristi za izravno otkrivanje – i karakterizaciju – genetskog materijala. PCR metodu stručnjaci smatraju jednostavnom za izvođenje, univerzalno primjenjivom i robusnom.
U laboratoriju se PCR test sastoji od dva koraka. U prvom koraku se pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) umnožava postojeći genetski materijal. To omogućuje ispitivanje najmanjih tragova DNK. To je i razlog zašto PCR testovi reagiraju tako osjetljivo.
U drugom koraku, genetski materijal se odvaja prema svojim svojstvima, "sortira" i tako karakterizira. Drugim riječima, utvrđuje se fina struktura DNK.
Postoji mnogo mogućih primjena: liječnici koriste PCR test, na primjer, za pregled briseva na prisutnost koronavirusa, davanje krvi na HIV ili za probir novorođenčadi na moguće nasljedne bolesti. Bakterijske infekcije – na primjer s uzročnikom tuberkuloze – ili parazitske infekcije (malarija) također se mogu razjasniti pomoću PCR-a.
Oni također pomažu u osudi počinitelja u sudskoj medicini na temelju njihovih genetskih otisaka prstiju ili se koriste kao testovi za utvrđivanje očinstva.
Koliko dugo vrijedi PCR test?
Rezultat PCR testa obično vrijedi 48 sati od trenutka uzimanja uzorka.
Koliko je pouzdan PCR test?
PCR je isprobana metoda detekcije u molekularnoj dijagnostici i medicini. Smatra se takozvanim zlatnim standardom s vrlo niskom stopom pogreške. Testovi se posebno odlikuju vrlo visokom osjetljivošću i specifičnošću.
Osjetljivost znači pouzdanost s kojom test pronalazi genetski materijal koji treba otkriti.
Specifičnost znači sigurnost s kojom se testom utvrđuje da dotični genetski materijal nije prisutan u uzorku.
Kada PCR testovi djeluju na infekciju Sars-CoV-2?
PCR test u pravilu otkriva korona infekciju dva do tri dana prije i do 20 dana nakon pojave simptoma. Čak i kod zaraženih ljudi koji ostaju potpuno bez simptoma, test je učinkovit u kritičnom vremenskom okviru kada mogu zaraziti druge.
U pojedinačnim slučajevima otkrivanje je čak moguće 60 dana nakon pojave simptoma.
Mogući izvori pogreške
Stopa pogrešaka u procesu kopiranja DNK u praksi je zanemariva. Iako DNA polimeraze nikada nisu bez grešaka, jedva da igraju ulogu u postupku PCR testa.
U praksi, potencijalni izvori pogreške više leže u prikupljanju uzoraka: stoga je važno da obučeni medicinski stručnjaci provode briseve. Uzorci sline i grgljanja mogli bi smanjiti točnost testa jer se ovdje pojavljuju učinci razrjeđivanja.
Kako radi PCR test?
PCR test provodi se, primjerice, kod obiteljskog liječnika ili u posebnim test centrima. Prvo liječnici ili obučeni medicinski stručnjaci uzimaju uzorak. Za test se obično uzima bris iz gornjih dišnih puteva. To je obično u obliku brisa usta ili nazofarinksa.
Moguće je i grgljanje otopinom za ispiranje. Uzorak krvi je netipičan za otkrivanje korone – ali se često koristi u probiru novorođenčadi, na primjer.
Bez obzira na vrstu uzetog uzorka, genetski materijal nalazi se na vatici, u otopini za ispiranje ili u kapi krvi. Ovaj uzorak materijala šalje se u laboratorij, gdje se izolira i pročišćava.
PCR test se zatim dijeli u dva koraka:
- PCR: U ovom koraku povećava se količina početnog genetskog materijala.
Korak 1: PCR – “lančana reakcija polimerazom”
"PCR" je prvi od dva koraka: Ovdje se umnožava količina dostupne početne DNK. To je zato što se genetski materijal može analizirati tek kada je dostupan u dovoljnim količinama. U većini slučajeva, ovo je ljudska DNK; u slučaju testova na koronavirus, to je virusna RNK.
Skraćenica PCR označava "lančanu reakciju polimeraze".
Što je potrebno za PCR?
Početna DNA se stavlja u reakcijsku posudu s posebnim tvarima. Postojeći genetski materijal služi kao predložak koji se kopira uz prisutnost određenih enzima (Taq polimeraza) i određenih osnovnih gradivnih blokova DNK.
Proces kopiranja odvija se u nekoliko ponavljajućih pokreta (ciklusa).
Konkretno, sljedeće tvari se dodaju zajedno:
- Početna DNK: Materijal uzorka koji se kopira.
- Osnovni građevni blokovi DNK: To su nukleobaze adenin, timin, citozin i gvanin.
- DNA polimeraza: enzim koji povezuje pojedinačne građevne blokove DNA u dobro definirani lanac DNA. Novodobivena niti je zrcalna slika (komplementarna) izvornog početnog materijala.
- Primeri: Sastoje se od 16 do 24 para baza i služe kao startna pozicija i startni signal. Primeri pokazuju DNA polimerazi na kojoj poziciji (početne DNA) počinje proces kopiranja.
Kako se provodi PCR test?
Sada kada su sve tvari potrebne za PCR prisutne u reakcijskoj posudi, stvarni proces kopiranja genetskog materijala može započeti. To se pokreće, kontrolira i ponovno zaustavlja isključivo temperaturom.
Reakcijska posuda se stoga jedna za drugom zagrijava ili hladi na različite temperature. To se radi pomoću posebnog uređaja poznatog kao termalni cikler. Cijela reakcija traje oko jedan do dva sata.
Pojedinačni koraci PCR ciklusa su
- Denaturacija dvostrukih lanaca DNA: Uzorak se zagrijava na oko 90 stupnjeva Celzijusa. Ovo razdvaja izvorni dvostruki lanac DNK u dva pojedinačna (komplementarna) jednostruka lanca.
- Pričvršćivanje temeljnih premaza: Temperatura se spušta na malo ispod 60 stupnjeva Celzijusa. To uzrokuje da se početnice (prednji početni, obrnuti početni) pričvrste na definirane položaje na odgovarajućim pojedinačnim lancima DNK.
Nakon završenog ciklusa, temperatura se ponovno podiže na oko 90 stupnjeva Celzijusa – ciklus ponovno počinje ispočetka.
Metoda PCR može se koristiti za umnožavanje sekvenci DNK do otprilike tri para kilobaza (kbp). To odgovara otprilike 3,000 osnovnih građevnih blokova DNK koji su međusobno povezani u "lanac". Za usporedbu: ljudski genom pohranjuje nacrte i informacije za rad stanice u oko tri milijarde parova baza – genom koronavirusa, s druge strane, sastoji se od 30,000 parova baza. PCR test stoga može samo umnožiti i ispitati kratke dijelove ukupne DNK.
Primeri su ključni
Odabir primera ključan je za PCR postupak. U dijagnostici Sars-CoV-2, primjerice, koristi se nekoliko primera (multiplex PCR).
Corona PCR testovi tako traže tri različita virusna gena: ovo povećava ukupnu specifičnost na gotovo 99.99%. To znači da uz ovu visoku stopu pogodaka postoji samo jedan lažno pozitivan test na 10,000 XNUMX testova (ako su uzorci pravilno uzeti).
Koliko je kopiranog genetskog materijala sada dostupno?
Pretpostavimo da su dva identična dvostruka lanca DNK prisutna nakon prvog ciklusa.
Nakon svakog ciklusa količina (kopiranog) genetskog materijala se udvostručuje. Količina DNK stoga eksponencijalno raste.
Liječnici obično ponavljaju ovaj postupak oko dvadeset do trideset puta.
Slikovito rečeno, to znači da čak i ako se u uzorku na početku nađe samo jedan dvostruki lanac DNK, nakon dvadeset ciklusa u reakcijskoj posudi već postoji milijun identičnih kopija.
Što znači vrijednost Ct?
Broj PCR ciklusa prikazan je u obliku tzv. Ct vrijednosti. “Ct” je izvedeno iz engleskog izraza “cycle threshold”. Ova vrijednost Ct omogućuje davanje izjava o količini genetskog materijala koji se traži.
Uz nisku vrijednost Ct od 20, ima puno početnog genetskog materijala. Međutim, ako je vrijednost Ct visoka – oko 30 ciklusa – postoji odgovarajuće malo DNK. Stoga se PCR ciklus mora provoditi češće.
Korak 2: Elektroforeza “Razvrstavanje po veličini”
Nakon što je dostupno dovoljno "obogaćenog" genetskog materijala, može se provesti elektroforeza. U ovom procesu znanstvenici iskorištavaju specifično svojstvo DNK: njen električni naboj.
Pojedinačni građevni blokovi DNK međusobno su povezani preko (negativno) nabijene šećerno-fosfatne okosnice. Što je duži određeni niz DNK, to je veći njegov električni naboj.
To omogućuje ispitivanje i karakterizaciju genetskog materijala. U praksi se nepoznati uzorak obično iscrtava u odnosu na poznatu referencu na "početnoj liniji" i uspoređuje se jedan s drugim nakon određenog vremenskog razdoblja.
Ako je "brzina migracije" ista za obje sekvence, to znači da je detekcija najvjerojatnije pozitivna: detekcija je vrlo vjerojatno pozitivna - gen koji tražite nalazi se u uzorku.
Poseban slučaj koronavirusa: priprema uzorka i RT-PCR
Otkrivanje koronavirusa je poseban slučaj. Sars-CoV-2 jedan je od takozvanih RNK virusa. To znači da je genetski materijal Sars-CoV-2 prisutan u obliku RNK (ribonukleinske kiseline).
RNK se razlikuje od DNK u samo nekoliko stvari. Između ostalog, prisutan je kao jedna nit i temelji se na šećeru ribozi umjesto na 2′-dezoksiribozi. Nukleobaza timin također je zamijenjena uracilom kao četvrtom bazom.
Ova virusna RNA mora se "prepisati" u DNA prije redovnog PCR testa. Taj se proces naziva obrnuta transkripcija (RT) – otuda i izraz RT-PCR. Kao dio ovog procesa dobiva se jedan lanac cDNA ("komplementarna DNA"). U daljnjem koraku, jednostruki lanac cDNA nadopunjuje se drugim lancem DNA u zrcalnoj slici.
Koliko vremena je potrebno da se dobije rezultat?
Nakon što je uzorak poslan u laboratorij, obično ćete dobiti rezultat u roku od jednog ili dva radna dana. U ispitnim centrima, koji često ispituju uzorke izravno na licu mjesta, to također može potrajati samo nekoliko sati. Vremenski raspon uvelike ovisi o dotičnom ispitnom centru i njegovoj logistici.
Unatoč složenim radnim procesima, moderni laboratoriji u mogućnosti su provoditi PCR testove s velikom propusnošću. Posebni automatizirani uređaji pomažu u provođenju testova.
Ipak, PCR test se smatra relativno “sporom” ali utoliko pouzdanijom metodom otkrivanja.
Što se događa ako je rezultat pozitivan?
Ako je uzorak pravilno uzet, pozitivan PCR test znači da postoji vrlo velika vjerojatnost da je testirana osoba zaražena Sars-CoV-2.
Ako vam je PCR testom potvrđena infekcija koronavirusom, zavod za javno zdravstvo će od nadležnog laboratorija dobiti obavijest o pozitivnom nalazu testa. U tom slučaju Zavod za javno zdravstvo odredit će izolaciju ili karantenu.
Jesam li automatski zarazan ako sam pozitivan na PCR?
Obično da. Ali ne uvijek. Rezultat PCR testa treba uvijek tumačiti u kontekstu. Pozitivan test prije svega znači da nosite virusni materijal.
Ponekad je koristan dodatni test na antitijela
U takvim slučajevima, test na antitijela pruža sigurnost koja potvrđuje valjanost PCR testa. Najbolje je o tome razgovarati sa svojim liječnikom. Oni vam mogu pomoći da ispravno protumačite rezultat PCR testa.
Što učiniti ako je nalaz negativan?
Negativan rezultat PCR testa najvjerojatnije znači da niste imali Covid-19 u trenutku uzimanja uzorka i stoga trenutno niste zarazni. Međutim, mogli biste biti u ranoj fazi infekcije.
Korona infekcije obično se mogu otkriti tek od drugog ili trećeg dana nakon infekcije. Rezultat stoga nije slobodan prolaz. Stoga se trebate nastaviti pridržavati pravila socijalnog distanciranja i higijene te nastaviti nositi FFP2 masku – radi vlastite zaštite i zaštite drugih.
PCR test za djecu
PCR test za djecu ne razlikuje se od PCR testa za odrasle. I prikupljanje uzorka i tumačenje rezultata odnosi se na djecu kao i na odrasle.
Koji su rizici PCR testa?
PCR test ne uključuje nikakve fizičke rizike. Samo uzimanje uzorka nazofaringealnog brisa neki ljudi doživljavaju kao uznemirujuće ili neugodno.
Koliko košta PCR test?
Imajte na umu: ako ste se testirali kod kuće i dobili pozitivan rezultat, trebali biste odmah telefonski dogovoriti pregled kod svog liječnika opće prakse. Vaš liječnik će razgovarati s vama o sljedećim koracima telefonom.
Inače, najbolje je nazvati broj 116 117 radi prijave za PCR test. U idealnom slučaju, trebali biste ostati kod kuće do potvrdnog testa kako biste zaštitili sebe i druge.
