Patch-clamp tehnika je naziv za elektrofiziološku tehniku mjerenja. Omogućuje mjerenje ionskih struja kroz pojedinačne kanale unutar plazmatske membrane.
Što je patch-clamp tehnika?
Tehnika patch clamp ili patch clamp metoda pripada elektrofiziologiji, koja je grana neurofiziologije koja se bavi elektrokemijskim prijenosom signala u živčani sustav. Pomoću ove metode moguće je vizualizirati pojedine ionske kanale u stanična membrana tjelesne stanice. To uključuje mjerenje struja nekoliko pikoampera. Tehniku patch-clamp prvi su put 1976. godine opisali njemački biofizičar Erwin Neher i njemački liječnik Bert Sakmann. Dvojica znanstvenika dobili su Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu 1991. godine za razvoj tehnike stezanja. Stoga je elektrofiziološka istraživanja gotovo revolucionirala tehnikom patch-clamp jer je otvorila mogućnost promatranja električnog ponašanja na membrani proteini pojedinca molekule. Pojam zakrpa dolazi iz engleskog jezika i znači "zakrpa". Odnosi se na mali membranski dio ispod flastere, koji se koristi kao mjerna elektroda. Tijekom postupka mjerenja, flaster membrane je fiksiran ili stegnut (za stezanje) na određene potencijale.
Funkcija, učinak i ciljevi
Tehnika patch-clamp je elektrofiziološka metoda analize. Temelji se na biološkoj činjenici da stanice imaju velik broj pora i ionskih kanala. U svakoj i izvan svake stanice javljaju se različite koncentracije ili naboji iona, što ovisi o fiziološkom stanju stanice. Lipidni dvoslojni sloj membrane nije propusan za voda molekule kao i ioni. Unatoč tome, razmjena nabijenih čestica odvija se preko stanična membrana u nepravilnim razmacima. Razlog tome je ovisnost napona ionskih kanala. Ako se postigne određeni membranski potencijal, kanali se otvaraju prema principu "sve ili ništa". Upravo tu dolazi tehnika zakrpe stezaljke. Na taj način, mjerna pipeta napreduje u ionski kanal bez prodiranja u stanična membrana. Na taj se način može točno odrediti lokalni električni potencijal. Struje curenja, koje bi mogle utjecati na rezultat mjerenja, obično se mogu izbjeći električno izuzetno tijesnim vezama između ruba pipete i stanične membrane. Metoda patch stezaljke temelji se na tehnici stezanja napona. Ovu tehniku razvio je 1930-ih američki biofizičar Kenneth Stewart Cole (1900.-1984.) Za mjerenje struja na netaknutim živčanim stanicama. U stezaljki za napon vrši se umetanje dviju elektroda u ćeliju kako bi se osigurao naredbeni ili zadržavajući napon. Istodobno, druga elektroda koristi se za bilježenje struja koje se javljaju preko membrane. Ako neurofiziolozi žele znati o protoku električnih struja kroz određena područja a živčana stanica membrane, koriste se tehnikom patch clamp. Da bi to učinili, koriste finu staklenu pipetu koja se postavlja na vanjsku stranu stanice. Negativni pritisak može se stvoriti usisavanjem uz pomoć hipodermijske šprice. Ovaj postupak dovodi do toga da se membrana lagano izboči na odgovarajućem mjestu. Negativni tlak osigurava pričvršćivanje stakla na membranu. To rezultira električnom izolacijom male membranske mrlje u pipeti od ostatka membrane. Za mjerenje električnih struja neurofiziolozi koriste pojačalo sa patch stezaljkom. Ovo je poseban mjerni uređaj. U idealnom slučaju, znanstvenik može pomoću uređaja dobiti podatke o električnim svojstvima pojedinih ionskih kanala. Jonski kanali reguliraju, na primjer, dotok i odtok natrij ioni, koji su pozitivno nabijeni, u živčanim stanicama. Istraga se odvija na stanicama ljudi, biljaka ili životinja. Metoda patch-clamp obično se izvodi na mjernoj stanici koja uključuje razne uređaje. Na mjernom stolu prigušenom vibracijama nalazi se takozvani Faradayev kavez koji služi kao električni štit. Nadalje, dostupan je optički mikroskop koji uključuje mikromanipulator za dovođenje flaster pipete u položaj. Uz to, držač pipete ima vezu s pretpojačalom, dok je držač uzorka povezan s elektrodom za kupku. Pojačalo s patch stezaljkom funkcionira za pojačavanje signala pretpojačala. Također je osiguran monitor za promatranje DUT-a kao i pipeta za flaster. U većini slučajeva računalo i nekoliko uređaja za pohranu podataka također su dostupni za mjernim stolom kako bi se omogućilo digitalno snimanje.
Rizici, nuspojave i opasnosti
Ne postoje rizici povezani s tehnikom flastera. Na primjer, stanice ljudi, životinja ili biljaka ispituju se tek nakon što su uklonjene. Rijetko postoji neograničen pristup vanjskoj staničnoj membrani. Iz tog je razloga često potrebno pripremiti stanice za metodu patch-clamp. Nakon punjenja flastera, steže se u mikromanipulator. To je povezano s pojačivačem patch stezaljke i lagano pritisnuto na netaknutu ćeliju. Postupak se može pratiti monitorom ili mikroskopom. Ispod pipete nalazi se komad membrane koji se naziva membranski flaster. Lagani negativni pritisak stvoren na stražnjem kraju pipete osigurava snažnu vezu između pipete i membrane. Ovaj postupak rezultira stvaranjem električnog otpora između vanjske otopine i unutrašnjosti pipete nekoliko gigaohms. Znanstvenici to nazivaju i "gigaseal", što omogućuje postizanje stanične konfiguracije metode flastera. Struja koja prolazi kroz ionski kanal u flasteru također teče kroz sadržaj pipete zbog velikog otpora gigaza. Elektroda spojena na pojačalo uronjena je u otopinu pipete, što omogućuje mjerenje aktivnosti pojedinih ionskih kanala unutar patch membrane.
